Thèse Mécanochimie des Défauts Topologiques au Sein de Monocouches Cellulaires Actives par Polarimétrie et Nanoimagerie Synchrotron Cryo-Corrélative H/F - Doctorat.Gouv.Fr

Établissement : Université Grenoble Alpes École doctorale : ISCE - Ingénierie pour la Santé la Cognition et l'Environnement Laboratoire de recherche : STROBE - Rayonnement Synchrotron pour la Recherche Biomédicale Direction de la thèse : Sylvain BOHIC ORCID 0000000163557592 Début de la thèse : 2026-10-01 Date limite de candidature : 2026-05-19T23:59:59 Les monocouches cellulaires confluentes se comportent comme des cristaux liquides nématiques actifs bidimensionnels dont l'orientation collective est ponctuée par des défauts topologiques de charge ±1/2. Dans les épithéliums, les endothéliums et d'autres systèmes vivants, ces défauts sont de plus en plus reconnus comme des centres organisateurs mécaniques associés à l'extrusion cellulaire, au remodelage local de la densité, à la déformation morphogénétique et aux dynamiques d'ordre collectif. Des travaux récents montrent en outre que les monocouches présentent un spectre d'ordres p-adiques (p = 2 à 6), chacun portant ses propres charges de défaut et appelant une caractérisation au-delà du paradigme standard ±1/2. Pourtant, une question fondamentale reste ouverte : quel est le paysage chimique intracellulaire au niveau d'un défaut topologique, et diffère-t-il de manière reproductible de celui des cellules situées dans des régions à topologie triviale ?
Cette thèse abordera cette question par une stratégie d'imagerie cryo-corrélative conçue pour préserver et cartographier l'état physico-chimique natif des cellules aux sites de défaut, en procédant en trois étapes. Premièrement, la microscopie à lumière polarisée quantitative LC-PolScope caractérisera le champ directeur nématique et la dynamique des défauts dans des monocouches cellulaires vivantes dans des conditions contrôlées. Deuxièmement, ces échantillons confluents pré-caractérisés seront vitrifié tout en préservant l'état ionique et métabolique natif. Troisièmement, des techniques de recalage seront adaptées aux images de l'échantillon vitrifié obtenues au microscope à fluorescence cryogénique (cryo-FLM) à la ligne de lumière ESRF ID16A, fournissant un moyen de relocaliser et d'identifier les sites de défauts topologiques directement sur le spécimen vitrifié. Les sites cartographiés guident ensuite la cryo-nano-XRF synchrotron (résolution 40-100 nm, détection multi-éléments simultanée) et l'imagerie par contraste de phase X de ces mêmes régions. Des stratégies de marquages bio-orthogonal permettent d'identifier des organites spécifiques (noyau, mitochondries, réticulum, gouttelettes lipidiques) au sein des cartes XRF, révélant quels compartiments sous-cellulaires subissent un remodelage chimique et mécanique au coeur des défauts.
La comparaison biologique centrale portera sur trois systèmes de monocouches complémentaires : MDCK-II comme modèle de référence des défauts épithéliaux actifs, MCF10A comme lignée de validation épithéliale humaine non transformée, et les monocouches HUVEC comme système endothélial humain expérimentalement accessible, complétés par la littérature plus large sur les dynamiques d'ordre médié par les défauts dans les couches endothéliales. Le projet quantifiera les régions où l'ordre nématique canonique domine et celles où une organisation p-adique d'ordre supérieur émerge. Au-delà de la production des premières cartes chimiques sous-cellulaires des cellules aux sites de défauts dans des monocouches vitrifiées, la thèse produira un pipeline de recalage défaut-vers-cryo-analyse en source ouverte, des stratégies de rapporteurs chimique spécifique d'organelles validées, et un cadre général pour l'étude de la mécanochimie des défauts topologiques dans les monocouches cellulaires. Cela devrait fournir une base pour de futures études en présences de différents types de stimuli, incluant le contrôle optogénétique de la formation des défauts, l'analyse des défauts résolue par cycle cellulaire, et la mécano-pharmacologie ciblée.
Confluent monolayers of elongated cells (epithelial, endothelial, or carcinomatous) spontaneously organize into two-dimensional active nematic liquid crystals, their orientational domains interrupted by topological defects of charge +1/2 (comet-shaped, self-propelled) and 1/2 (trefoil-shaped). Saw et al. [1] established that +1/2 defects in MDCK epithelia are the primary sites of apoptotic cell extrusion, driven by compressive stress from convergent active flows and transduced via YAP signaling, caspase-3 activation, and the ENaC/Piezo1 ion channel cascade. The same defect physics underpins morphogenetic protrusions in myoblasts, Hydra, and MDCK domes [2], and governs the ordering kinetics of aortic endothelial cells under physiological shear flow through multicellular string excitations [4]. Shankar et al. [3] formalized the control of active defects through symmetry-based selection rules, showing that spatial activity gradients act as 'topological tweezers' capable of positioning and braiding defects on demand, a framework directly relevant to future optogenetic experiments. Happel et al. [5] showed that MDCK monolayers simultaneously harbor p-atic orders from p = 2 (nematic) to p = 6 (hexatic), each generating defects of charge ±1/p, calling for a characterization framework beyond the standard ±1/2 paradigm.
Despite this rapidly maturing understanding of defect mechanics, the intracellular chemical landscape at defect sites (ionic gradients, metabolic state, organelle involvement) has never been mapped at subcellular resolution in the native frozen state. This thesis addresses the gap through a correlative cryo-imaging workflow in three stages. First, LC-PolScope quantitative polarized light microscopy maps the nematic director field in real time, without labels, characterizing defect dynamics in cells grown on SiN membranes. Second, confluent monolayers are vitrified by plunge-freezing to preserve the native ionic distribution. Third, defect sites are relocated on the frozen sample by adapting registration approaches to the cryo-FLM at the ESRF ID16A beamline, guiding synchrotron cryo-nano-XRF and X-ray phase contrast imaging of the same regions. ID16A focuses a pink beam (17 or 33.6 keV) to a 13-50 nm spot and detects X-ray fluorescence from all elements simultaneously in vitrified samples; K, Cl, Ca, P, S, Fe, and Zn are routinely mapped at sub-ppm sensitivity, reporting on ionic balance, metabolic state, and enzyme distribution.
The methodological advance that makes this thesis timely is the recent demonstration in our cryo-correlative work [6] that bio-orthogonal labeling strategies can be integrated into the cryo-CLXM workflow. Bio-orthogonal probes (metabolic labels conjugated to organelle-specific heavy-atom reporters) allow identification of mitochondria, ER, and lysosomes within XRF maps without perturbing cell biology. This opens questions inaccessible to existing methods: which organelles undergo chemical remodeling at defect cores? Do mitochondria distinguish cells destined for extrusion from survivors? Does the ER display a Ca²/Piezo1-related chemical signature at +1/2 heads that precedes extrusion?
- Characterize active nematic and p-atic order in MDCK-II, MCF10A and HUVEC monolayers to determine whether these cell types establish reproducible nematic and higher-order p-atic organization at confluence on SiN membranes; extract director fields, defect densities, velocities and higher-order symmetries using LC-PolScope quantitative polarized-light microscopy and Minkowski tensor shape analysis.
- Optimize and validate bio-orthogonal labeling protocols for organelle classes (nucleus, mitochondria, ER, lipid droplets) detectable by cryo-nano-XRF via incorporated heavy-atom reporters, drawing on strategies demonstrated in our recent cryo-correlative work [6, 7], and confirm that labeling does not perturb active nematic dynamics.
- Establish vitrification protocols for confluent monolayers on SiN membranes that preserve the native ionic and biochemical state, and adapt registration approaches to the cryo-FLM at the ESRF ID16A beamline to relocate and identify topological defect sites directly on frozen-hydrated samples.
- Acquire cryo-nano-XRF elemental maps (K, Cl, Ca, P, S, Fe, Zn and bio-orthogonal probe signals) and X-ray phase-contrast images at ESRF ID16A for defect sites identified by cryo-FLM; build a statistically powered dataset (20 defect events, 3 biological replicates per cell type) correlating elemental and organelle distributions with defect topology versus bulk regions.
- Compare elemental signatures across cell types (MDCK-II, MCF10A and HUVEC) to distinguish universal from cell-type-specific chemical features of topological defects; assess whether defect-associated ionic signatures are consistent with predictions from mechanotransductive models involving ENaC, Kv, SWELL1 and Piezo1, and identify the most plausible pathways for subsequent perturbative testing.
- Develop and release an open-source computational pipeline integrating LC-PolScope director-field extraction, p-atic order analysis, automated defect tracking, cryo-FLM defect relocation, XRF elemental quantification and organelle registration from bio-orthogonal probe channels, designed to be extensible to other active nematic biological systems.
Cell culture, LC-PolScope characterization, and bio-orthogonal labeling (Months 1-10). Three cell lines will be established on fibronectin-coated SiN membranes (50 nm thick, 1.5×1.5 mm window): MDCK II, HUVECs, and MCF-10A. LC-PolScope acquisition will be optimized for each line, with automated defect detection, charge assignment, velocity tracking, and p-atic order extraction implemented following Happel et al. [5]. In parallel, organelle-specific bio-orthogonal labeling protocols for mitochondria, ER, and lysosomes will be developed drawing on our cryo-correlative work [6], optimizing heavy-atom reporter conjugation for XRF detectability. The impact of labeling on active nematic dynamics will be assessed by LC-PolScope time-lapse before any synchrotron campaign.
Vitrification, cryo-FLM defect relocation, and first synchrotron campaign (Months 8-18). Plunge-freezing protocols will be established for confluent monolayers on SiN membranes, with trace-element-free buffer rinsing to remove extracellular salts. We will adapt our recently developed automation approach [7] to relocate defect sites on vitrified samples and XRF denoising framework for dose efficiency and increased sensitivity [8]. The first beamtime will acquire cryo-nano-XRF elemental maps (K, Cl, Ca, P, S, Fe, Zn) and X-ray phase contrast images at defect cores versus bulk regions, and validate co-registration of bio-orthogonal probe signals with expected organelle positions.
Statistical dataset, cross-cell-type comparison, and p-atic extension (Months 18-28). A dataset of 20 defect events per cell type (3 biological replicates) will be accumulated across MDCK-II, MCF10A, and HUVEC s over successive beamtimes. Cross-type comparison will identify which elemental signatures at defects are universal and which are cell-type-specific. The analysis will extend to higher-order p-atic defects (p = 2 to 6).
Computational pipeline (Months 20-30). An open-source pipeline will integrate director field extraction, p-atic order analysis, defect tracking, cryo-FLM relocation, XRF spectral deconvolution, and organelle registration from bio-orthogonal channels. Spatial statistics of elemental composition as a function of distance and angle relative to defect cores will be compared with predictions from continuum active nematic models.
Thesis writing (Months 30-36). Manuscript preparation and thesis writing, with publications targeted throughout the project.
Contingency. If bio-orthogonal labeling perturbs active nematic dynamics, the project focuses on mapping native elemental redistributions at defect cores in unlabeled cells. This dataset alone is novel: no cryo-XRF elemental map at individual topological defect sites exists in any biological system. All other objectives remain intact.

Master (ou équivalent) en biophysique, physique, ou une discipline connexe (chimie physique, ingénierie biomédicale, biologie quantitative). Une solide formation en physique de la matière molle, mécanique cellulaire, ou imagerie biomédicale est requise. De fortes compétences en programmation scientifique (Python, analyse d'images, traitement quantitatif des données) sont indispensables dès le premier jour. Capacité démontrée à travailler de manière autonome et à communiquer en anglais (niveau minimum B2).
Compétences enseignées intégralement durant la thèse :
La culture cellulaire avancée sur membranes de SiN, la préparation cryogénique des échantillons (congélation par trempe, cryo-FLM) et le marquage bio-orthogonal seront intégralement enseignés à l'ESRF ; aucune expérience préalable dans ces domaines n'est requise. Les techniques synchrotron (cryo-nano-XRF, cryo-CLXM) seront couvertes de manière approfondie par l'École Européenne HERCULES et les ateliers de l'ESRF. Le candidat devra apporter de la curiosité pour les systèmes interdisciplinaires (physique / biologie cellulaire / chimie analytique) et la capacité à travailler au sein d'une équipe internationale.

• Chimie