Thèse Imagerie de Voltage et Calcique dans les Tranches de Cerveau pour une Sélection sans Précédent de Médicaments Candidats pour les Maladies Neurologiques H/F - 38

Établissement : Université Grenoble Alpes
École doctorale : PHYS - Physique
Laboratoire de recherche : Laboratoire Interdisciplinaire de Physique
Direction de la thèse : Marco CANEPARI ORCID 0000000197592388
Début de la thèse : 2026-10-01
Date limite de candidature : 2026-05-13T23:59:59

La tranche de cerveau est une préparation ex vivo devenue essentielle en recherche préclinique, notamment pour les tests de médicaments et la validation de modèles animaux. En effet, les tranches de cerveau présentent des avantages similaires aux cultures neuronales dissociées, car les neurones sont accessibles à l'étude électrophysiologique. Cependant, contrairement aux préparations in vitro, les cellules et les circuits locaux sont préservés dans leur environnement physiologique, mimant ainsi les conditions in vivo. C'est pourquoi de nombreuses CRO (Contract Research Organizations) utilisent aujourd'hui les tranches de cerveau pour la sélection préclinique de nouvelles molécules candidates, principalement par la technique du patch-clamp manuel. Cette approche est toutefois chronophage, requiert l'expertise d'électrophysiologistes et ne fournit qu'une information incomplète sur les effets des médicaments au niveau du réseau. Pour le criblage de médicaments sur tranches de cerveau, ce projet propose de remplacer la technique du patch-clamp par une approche innovante combinant l'imagerie du potentiel membranaire (Vm) et du Ca2+, développée et validée au Laboratoire Interdisciplinaire de Physique (LIPhy) de Grenoble [Ghasemiform & Canepari, 2025]. Alors que les enregistrements patch-clamp permettent d'obtenir des informations sur l'excitabilité neuronale et la transmission synaptique au niveau de neurones individuels, l'imagerie combinée Vm et Ca2+ permet d'enregistrer les signaux électriques et chimiques de populations de centaines de neurones dans des régions cérébrales relativement étendues. Cette technique apporte ainsi des informations sur l'activité du réseau, essentielles pour comprendre le mode d'action du médicament et prédire ses effets secondaires potentiels. De plus, comme 6 à 8 tranches peuvent être analysées quotidiennement et de manière routinière chez une seule souris, cette méthode permet d'obtenir en quelques semaines des caractérisations de médicaments qui nécessitent des mois de travail avec la technique patch-clamp. Elle raccourcit ainsi considérablement le processus de sélection des composés candidats, actuellement une source majeure de retard dans le développement de médicaments. Enfin, contrairement au patch-clamp manuel, l'imagerie combinée Vm et Ca2+ peut potentiellement être automatisée grâce au développement de stations de travail dédiées, un objectif de transfert de technologie à long terme du laboratoire.

La recherche neuropharmacologique est actuellement guidée par la recherche de nouvelles cibles thérapeutiques, un objectif particulièrement complexe lorsque les effets de la modulation d'un canal ionique ou d'un récepteur spécifique (cibles thérapeutiques majeures) sont encore mal connus. Dans ce processus de recherche, l'efficacité de la phase préclinique de sélection des candidats médicaments repose initialement sur la capacité à cribler des milliers de molécules ciblant une cible donnée, puis sur l'étude précise des effets secondaires potentiels, qui peuvent s'avérer critiques lors des essais cliniques. Si un criblage moléculaire rapide peut être initialement réalisé in vitro (lignées cellulaires ou cultures de cellules dissociées) par électrophysiologie automatisée, la validation des médicaments doit finalement être effectuée chez l'animal vivant (in vivo), une étape où les protocoles expérimentaux sont longs, coûteux et peuvent être soumis à des restrictions bioéthiques. Une phase intermédiaire de tests sur des tissus physiologiques (ex vivo) est nécessaire pour affiner le criblage des molécules ayant passé la phase in vitro avant leur application in vivo. La tranche de cerveau est une préparation ex vivo où les cellules et les circuits natifs sont partiellement préservés et peuvent être visualisés et étudiés par des techniques électrophysiologiques. En France, des organismes de recherche sous contrat (CRO) tels qu'E-Phys science (https://www.e-phy-science.com/en/) ou Neuroservice (https://www.neuroservice.com/) proposent des services d'évaluation de médicaments sur des neurones issus de tranches de cerveau provenant de différentes régions cérébrales. Ces évaluations sont réalisées à l'aide de la technique du patch-clamp manuel et visent à combler les limites entre la phase in vitro et la phase in vivo de la sélection de composés candidats. Les évaluations sur tranches de cerveau peuvent également être utiles pour caractériser les modèles animaux de maladies qui jouent un rôle primordial dans la recherche biomédicale.

L'objectif est de fournir une preuve de concept sur la façon dont l'imagerie combinée voltage et calcique peut contribuer de manière unique à la « sélection des candidats » dans la recherche préclinique.

Les expériences seront réalisées au LIPhy conformément à la directive européenne 2010/63/UE relative à la protection des animaux. Les procédures ont déjà été validées par l'animalerie de la LBFA (https://lbfa.univ-grenoble-alpes.fr/). Pour le chargement des indicateurs de Ca², les tranches sont incubées dans une solution extracellulaire contenant 1 à 2 µM de Calbryte 520 sous forme AM-ester, puis transférées dans la chambre d'enregistrement où elles sont colorées pendant environ une minute avec 7,5 µM d'EF-630. Le dispositif utilisé par le candidat repose sur un microscope Olympus BX51 équipé d'un objectif 25X/1,05 NA. Le diamètre du champ de vision est d'environ 720 µm et les images sont enregistrées avec une résolution d'environ 1 µm sur la plus grande portion possible de l'hippocampe grâce à une caméra CMOS ultrarapide Kinetix (Teledyne Photometrics, Tucson, AZ). Chez la souris, cette configuration permet de visualiser la dernière partie de la région CA3 et la majeure partie de la région CA1. Les images sont acquises à une fréquence d'acquisition de 5 kHz avec une profondeur de 8 bits. Pour la stimulation électrique, des pipettes remplies de solution extracellulaire ou du « générateur d'activité physiologique » seront utilisées. La fluorescence de l'EF-630 est excitée par la raie à 640 nm d'un laser LDI-7 (89 North, Williston, VT) et la fluorescence émise est filtrée passe-bande à 728 ± 64 nm. La fluorescence du Calbryte520 est excitée par une OPTOLED de 470 nm (Cairn Research, Faversham, Royaume-Uni) et la fluorescence émise est filtrée passe-bande à 530 ± 21 nm. Les images sont ensuite enregistrées avec le logiciel libre Micro-Manager et les données sont analysées sous MATLAB ou en Python.