Thèse Décrypter le Rôle de la Protéine Npm1 dans la Réparation de l'Adn Analyse Structurale des Interactions Moléculaires avec l'Ap Endonucléase Humaine Ape1 H/F - 38

Établissement : Université Grenoble Alpes
École doctorale : CSV- Chimie et Sciences du Vivant
Laboratoire de recherche : Institut de Biologie Structurale
Direction de la thèse : Marjolaine NOIRCLERC-SAVOYE ORCID 0000000254816561
Début de la thèse : 2026-10-01
Date limite de candidature : 2026-04-09T23:59:59

La nucléophosmine 1 (NPM1) est une protéine humaine multifonctionnelle, composant majeur du nucléole. NPM1 a été identifiée comme un régulateur de la voie de réparation de l'ADN par excision de base (BER), utilisée par les cellules pour restaurer l'intégrité de leur génome à la suite d'une exposition à un stress oxydatif (d'origine endogène ou exogène), à des rayonnements ionisants ou à divers agents chimiothérapeutiques. NPM1 régule la stabilité, l'activité et la localisation nucléolaire des protéines impliquées dans la voie BER, dont celle de l'AP endonucléase (APE1) - qui reconnait et modifie les sites apyrimidiques/apuriniques (AP) générés dans ces conditions. Des données récentes indiquent que (i) NPM1 et APE1 sont surexprimées dans différents types de tumeurs et que (ii) l'interaction NPM1/APE1 contribue à la résistance de certaines cellules cancéreuses à des composés de platine utilisés en chimiothérapie, faisant de l'interface NPM1/APE1 une cible thérapeutique pertinente. Bien que l'interaction directe entre NPM1 et APE1 ait été identifiée, les bases moléculaires ainsi que le rôle de cette association dans le développement de la chimio-résistance demeurent inconnus.
L'objectif du projet est d'élucider par une approche structurale intégrative - combinant des tests d'activité, des mesures d'interactions biophysiques, des études structurales et de l'imagerie cellulaire -, les mécanismes moléculaires conduisant à l'interaction NPM1/APE1. Une connaissance approfondie de l'interaction NPM1/APE1, en présence ou non d'ADN endommagé contenant un site AP, permettra : (i) de clarifier les mécanismes de reconnaissance entre NPM1 et APE1, encore largement inconnus, et d'identifier de façon exhaustive les résidus impliqués dans la formation du complexe, (ii) de comprendre le rôle des régions désordonnées des deux protéines dans cette interaction, (iii) de caractériser le rôle de NPM1 vis à vis de APE1 in cellulo dans des conditions normales ou suite à une exposition à un stress oxydatif ou au cisplatine, et (iv) d'identifier des inhibiteurs potentiels de cette interaction.
A plus long terme, nous espérons qu'une compréhension fine de l'interface NPM1/APE1 ouvrira la voie à de nouveaux agents thérapeutiques ciblés, capables de contourner la chimiorésistance et d'offrir des retombées cliniques majeures pour le traitement de cancers aujourd'hui difficiles à éradiquer.

Contexte scientifique
Notre génome est constamment exposé à des sources de dommages de l'ADN, qu'elles soient endogènes ou exogènes, dont l'une des conséquences les plus fréquentes est la formation de sites apuriniques/apyrimidiques ou sites abasiques (AP), conduisant à une perte de l'information génétique. Afin de maintenir l'intégrité génomique et prévenir l'apparition de mutations pouvant conduire à divers types de cancers, les cellules déploient plusieurs mécanismes de détection et de réparation de l'ADN, capables de cibler spécifiquement un type de lésion. Dans le cadre de traitements anticancéreux, ces systèmes sont saturés par les agents chimiothérapeutiques qui provoquent des lésions irréparables et induisent ainsi l'apoptose des cellules tumorales. L'augmentation de la capacité de réparation de l'ADN des cellules tumorales constitue l'un des mécanismes de chimiorésistance observés.
La protéine Nucléophosmine 1 (NPM1) a été identifiée comme un acteur central dans plusieurs voies de réparation de l'ADN et plus particulièrement dans la réparation par excision de bases (BER). NPM1 régule la stabilité, l'activité et la localisation nucléolaire des protéines impliquées dans cette voie, dont l'endonucléase apurinique/apyrimidinique 1 (APE1), une enzyme essentielle de la voie BER. Bien que l'interaction directe entre NPM1 et APE1 ait été identifiée, les mécanismes moléculaires de cette association demeurent encore mal compris. Les expressions accrues de NPM1 et APE1 observées dans différents types de cancers, et leur rôle clé dans la résistance de certaines cellules tumorales aux agents chimiothérapeutiques, positionnent l'interface NPM1/APE1 comme une cible thérapeutique prometteuse.

1 - La protéine humaine NPM1 : un régulateur essentiel de la voie BER et un acteur clé dans la cancérogénèse humaine
NPM1 est une protéine nucléocytoplasmique multifonctionnelle, impliquée dans des processus cellulaires variés tels que la biogenèse des ribosomes, la régulation du cycle cellulaire, la réparation de l'ADN et l'apoptose (1-4). Composant majeur du nucléole, NPM1 peut rapidement migrer vers le nucléoplasme et le cytosol, en réponse à des stimuli de stress, ou des modifications post-traductionnelles (PTM) (5). NPM1 joue un rôle clé dans la cancérogenèse humaine, avec des altérations fréquentes de son expression et de l'intégrité de ses gènes (6). NPM1 appartient à une nouvelle catégorie de gènes agissant comme oncogènes ou suppresseurs de tumeurs, selon (i) son niveau d'expression, (ii) la perte partielle de ses fonctions ou (iii) sa surexpression aberrante, pouvant induire une transformation cancéreuse (7). Bien que plusieurs études rapportent que l'expression de NPM1 est élevée dans plusieurs types de cancers, les mécanismes de régulation de NPM1 et son rôle dans la pathogénèse moléculaire du cancer humain restent à élucider.
NPM1 (37 kDa) est organisée en trois domaines fonctionnels impliqués dans des interactions qui ont lieu dans le cytoplasme et/ou dans le compartiment nucléaire/nucléolaire de la cellule (8) : un domaine d'oligomérisation N-terminal (NPM1-OD), un domaine central de liaison aux histones (NPM1-HBD) et un domaine C-terminal de liaison aux acides nucléiques (NPM1-RBD), indispensable au ciblage nucléolaire de NPM1 (Fig. 1A) (9-11). D'un point de vue structural, NPM1-OD est un tonneau compact, capable de former un pentamère ou un décamère, NPM1-HBD est prédit comme intrinsèquement désordonné, tandis que le domaine C-terminal NPM1-RBD est constitué de 3 hélices (Fig. 1A).

2- La protéine humaine APE1 : un acteur clé dans la voie BER, impliqué dans plusieurs types de cancers
APE1 est l'enzyme principale impliquée dans la réparation des lésions AP, particulièrement active en réponse aux dommages oxydatifs induits par le métabolisme cellulaire ou les agents génotoxiques (12). APE1 reconnaît et clive les sites AP générés spontanément ou produits par des ADN glycosylases spécialisées, permettant à l'ADN polymérase de combler le/les nucléotide(s) manquant(s) et de réparer les lésions (Fig. 1B). De plus, APE1 stimule l'activité de liaison à l'ADN de divers facteurs de transcription (tels que p53, NF-B et STAT3), jouant ainsi un rôle crucial dans la régulation de l'expression des gènes. Bien que APE1 soit essentielle à la voie BER (12), les mécanismes qui régissent son activité enzymatique restent encore largement incompris (13).
APE1 est une protéine nucléocytoplasmique dont la distribution subcellulaire est principalement nucléaire, mais qui peut se localiser dans d'autres compartiments selon l'état physiologique de la cellule (14), la régulation de ses interactions protéine-protéine et de ses PTMs. Son enrichissement relatif dans le nucléole apparaît être déterminé par son interaction avec NPM1 (15) et une corrélation positive a été observée entre la surexpression du gène APEX1 (codant pour APE1) et le développement de plusieurs tumeurs (16).
La protéine APE1 humaine (35 kDa) se compose principalement d'un domaine globulaire, contenant l'activité nucléase, précédé d'une région N-terminale flexible et désordonnée, impliquée dans la localisation, les PTM et les interactions protéine-protéine (Fig. 1C) (13). Bien que l'organisation et la fonction de cette région intrinsèquement désordonnée (IDR) reste à déterminer, elle semble jouer un rôle régulateur dans la fonction de l'enzyme, sans être strictement nécessaire à son activité (13). Les différentes structures du domaine endonucléase d'APE1 déterminées à résolution atomique révèlent une conformation en sandwich /, qui ne change pas de manière significative lors de sa fixation à l'ADN (17).

3 - NPM1 et APE1 : une interaction essentielle et une cible thérapeutique potentielle
L'interaction directe de NPM1 avec APE1 module la localisation subcellulaire et l'activité endonucléase d'APE1 (18). Elle est directement impliquée dans (i) la localisation nucléolaire d'APE1, (ii) la localisation cytoplasmique anormale d'APE1 dans des cellules de leucémie myéloïde aiguë (AML), entrainant un défaut de réparation de l'ADN par la voie BER et (iii) la stimulation de l'activité endonucléase d'APE1, contribuant à la résistance de certaines cellules cancéreuses à la cytotoxicité de sels de platine. NPM1 favoriserait la reconnaissance du site abasique par APE1 tout en inhibant ses associations non spécifiques à l'ADN 1. Des données récentes indiquent (i) que l'expression de NPM1 et APE1 est fortement augmentée dans divers cancers, (ii) que NPM1 et APE1 sont associées à un pronostic défavorable et constituent de potentielles cibles thérapeutiques et (iii) que l'interaction NPM1/APE1 contribue à la résistance de certaines cellules cancéreuses à certains agents de chimiothérapie, notamment les sels de platine. Ces observations positionnent l'interface NPM1/APE1 comme une cible thérapeutique pertinente et prometteuse (16,19).
Les domaines NPM1-OD et NPM1-HBD ont été identifiés comme les sites d'interaction avec la région N-terminale et le domaine globulaire d'APE1 (13,18). Les 33 premiers résidus de la région N-terminale d'APE1 seraient nécessaires pour une interaction stable avec NPM1-OD, bien que la partie proximale de la région de liaison de NPM1 (NPM1-HBD) et le domaine globulaire d'APE1 participeraient aussi à la formation d'un complexe stable. Cependant, aucune information structurale du complexe NPM1/APE1, ni aucun détail moléculaire sur cette association, ne sont disponibles à ce jour.

L'objectif principal de ce projet est de caractériser les bases moléculaires et structurales du complexe NPM1/APE1, qui nous permettront, à plus long terme, de développer des inhibiteurs spécifiques de cette interface, susceptibles de constituer une nouvelle approche thérapeutique pour les tumeurs chimio-résistantes présentant des niveaux élevés de NPM1 et APE1.

Cette étude sera menée à travers une approche intégrative, combinant des tests d'activité, des mesures d'interactions biophysiques, des analyses structurales (RMN, cryo-ME), et de l'imagerie cellulaire.

WP1- Complexe NPM1/APE1 : caractérisation structurale par cryo-ME et RMN
1- L'étudiant sera chargé de la production et la purification des protéines/domaines NPM1 et APE1 nécessaires au projet. Toutefois, il pourra compter sur le soutien de personnels techniques de l'équipe.
2- Caractérisation du complexe NPM1/APE1 par cryo-EM (Collaboration pour la préparation des grilles, leur congélation et la collecte des données). L'étudiant participera activement au traitement des données et à la reconstitution d'une carte 3D à résolution atomique à l'aide du logiciel CryoSPARC.
3- Caractérisation du complexe NPM1/APE1 par RMN (Collaboration pour l'enregistrement et le traitement des données). L'étudiant prendra en charge l'analyse des données afin de réaliser la modélisation des interactions.

WP2- Régulation de l'activité d'APE1 par NPM1 : étude in vitro et in cellulo
1- Caractérisations biophysiques des interactions NPM1 et APE1 en absence et en présence d'ADN contenant un site abasique : L'étudiant sera responsable de la réalisation d'un sous-ensemble des approches biophysiques mentionnées dans le projet (polarisation de fluorescence, photométrie de masse, SEC-MALS, AUC, ITC, TSA, nano-DSF, réticulation chimique couplée à la spectrométrie de masse,...), à l'exception des expériences de SEC/MALS, AUC et spectrométrie de masse dont l'acquisition et le traitement des données seront prise en charge par les PF spécialisées.
2- Tests d'activité d'incision et de liaison à l'ADN de APE1 en absence et en présence de NPM1 : L'étudiant sera responsable des tests d'incision et de liaison à l'ADN de APE1, mais il pourra bénéficier du soutien de personnels techniques de l'équipe pour leur réalisation.
3- Caractériser l'interaction de NPM1/APE1 par la technique de FRET (biocapteur) : La mise au point du biocapteur sera confiée à 2 chercheurs de l'équipe, afin de bénéficier de leurs expertises dans le domaine.
4- Criblage de chimiothèques existantes : Les tests de criblage de chimiothèques seront réalisés, si le temps le permet et des fonds levés, par la PF de criblage de petites molécules du CEA (GAP2D), en utilisant les conditions de FRET développées au laboratoire. L'analyse des résultats sera principalement assurée par la PF GAP2D.
5- Visualisation par immunofluorescence des protéines endogènes NPM1 et APE1 : Les immunomarquages seront effectués par un chercheur de l'équipe et les acquisitions seront réalisées sur la PF M4D, sous la supervision de son responsable.
6- Constructions génétiques pour exprimer des protéines APE1Mutante et NPM1Mutante dans un contexte cellulaire : Dans un premier temps, une seule version pour chaque protéine, intégrant l'ensemble des mutations identifiées comme inhibant l'interaction entre les deux protéines sera commandée et synthétisée par une entreprise spécialisée.
7- Étude des interactions APE1/NPM1 in cellulo, en conditions contrôles ou à la suite de stress oxydant : En fonction de l'avancée du projet, l'étudiant pourra participer aux cultures cellulaires et préparations des lames, en collaboration avec 2 chercheurs de l'équipe. Les visualisations seront effectuées sur la plateforme M4D.